
實驗背景
人類 PBMC 包含多種免疫細胞類型,例如 T 細胞、B 細胞、自然殺手細胞 (NK 細胞)、樹突狀細胞和單核細胞。傳統流式細胞儀由於染料數量限制和光譜重疊問題,難以同時分析大量標記。SONY ID7000 利用光譜拆解技術,通過捕捉每個染料的完整光譜指紋並應用加權最小二乘法 (WLSM) 演算法進行拆解,突破了這些限制。
文獻中使用配備 5 個雷射的 ID7000,對 PBMC 樣本進行 42 色分析,旨在精確識別多種免疫細胞亞群,並展示光譜拆解技術在高參數分析中的準確性和靈活性。
樣本準備
- PBMC 隔離:從健康捐贈者的新鮮血液樣本中,採用 Lymphopure™ 密度梯度離心法分離 PBMC。
- 染色:將 PBMC 細胞懸浮液調整至 1×10^7 細胞/mL,使用包含 42 種螢光標記的抗體混合物進行染色,在 4°C 下避光孵育 30 分鐘。
- 洗滌與固定:染色後,細胞以 PBS 洗滌兩次,並使用 2% 甲醛固定。
儀器設置
- ID7000 配置:儀器配備 5 個雷射 (355 nm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm) 和 184 個檢測器,覆蓋 360 nm 至 920 nm 的檢測範圍。
- 光譜庫:使用單染beads生成 42 種染料的光譜指紋,儲存於光譜庫中供後續拆解使用。
- 拆解演算法:採用 WLSM 演算法進行光譜拆解,自動校正自發螢光並處理染料間的光譜重疊。
數據分析
- 軟件:使用 SONY 專有軟件完成數據採集和光譜拆解。
- Gating 策略:根據附件 Figure 8 提供的 gating 策略,識別 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、樹突狀細胞和單核細胞等亞群。

光譜拆解的優勢
- 染料解析:ID7000 成功分離光譜高度相似的染料,例如 PE-eFluor™ 610、Alexa Fluor 594 和 PE-Alexa Fluor 610( Figure 7),展現了其在高參數Panel設計中的靈活性。
- 自發螢光處理:通過將自發螢光作為獨立參數進行拆解,有效消除了假陽性訊號,提升了細胞群體的分辨清晰度。
42 色Panel的應用
- 亞群識別:使用 42 種標記,成功解析 PBMC 中的多種免疫細胞亞群,包括:
- T 細胞:CD4+ 和 CD8+ T 細胞,以及其記憶和效應亞群。
- B 細胞:CD19+ 和 CD20+ B 細胞。
- NK 細胞:CD56+ 和 CD16+ 亞群。
- 樹突狀細胞:CD11c+ 和 HLA-DR+ 亞群。
- 單核細胞:CD14+ 和 CD16+ 亞群。
- 高解析度:光譜拆解技術確保了即使在 42 色Panel中,各亞群的訊號仍能清晰分離,無明顯的訊號重疊或假陽性結果。

Panel設計的考量
- 染料選擇:根據染料亮度、抗原密度和溢漏擴散矩陣 (Spillover Spreading Matrix, SSM),優化染料分配。例如,將光譜相似的 BB515 和 Alexa Fluor 488 分別用於 CD19 和 CD8,避免雙陽性群體的解析困難(Figure 8)。
- SSM 應用:SSM 幫助指導高干擾染料的分配,確保生物學上互斥的標記使用相近染料,從而減少拆解誤差。
光譜庫的效益
- 重用性:光譜庫支持單染光譜的重複使用,減少每次實驗的準備時間和試劑成本。
- 一致性:標準化的光譜參考模式確保了不同實驗間數據的一致性,提升了實驗的可再現性。
自發螢光的處理
- 獨立參數:將自發螢光作為獨立「顏色」進行拆解,有效降低了其對染料訊號的干擾,尤其在分析內源螢光較強的細胞時效果顯著。
結論
SONY ID7000 光譜流式細胞儀憑藉其先進的光譜拆解技術,成功實現了 PBMC 的 42 色分析,為高參數免疫細胞研究提供了強大支持。其自動化功能、標準化流程和光譜庫的應用顯著提升了實驗效率和數據品質。未來,隨著技術的不斷進步,SONY 無濾鏡真實光譜流式細胞儀有望在更多研究領域發揮重要作用,推動生命科學的發展。
參考文獻
- Futamura K, et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes. Cytometry A. 2015;87A:830-842.
- SONY Biotechnology Inc. Forty-two Color Flow Cytometry Panel Data Collected with the ID7000™ Spectral Cell Analyzer for Identifying Cellular Subsets in Human Peripheral Blood.
- Nguyen R, et al. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 2013;83:306-315.
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