SONY 光譜流式細胞儀的原理與優勢

在生命科學研究領域,流式細胞儀 (Flow Cytometry) 是分析單個細胞或微粒多重特性的重要工具。隨著研究的深入,科學家對同時分析更多細胞參數的需求日益增加,推動了多色流式細胞儀技術的發展。SONY Biotechnology 憑藉其創新的光譜拆解 (Spectral Unmixing) 技術,在2012年發表世界上第一台商用化光譜式流式細胞儀,為高參數多色細胞分析帶來革命性進展。本文將詳細介紹 SONY 光譜流式細胞儀的原理、與傳統螢光補償的差異、技術優勢,並探討其在科學文獻中的應用實例。

傳統流式細胞儀依賴濾光片 (bandpass filters) 和單通道光電倍增管 (Photomultiplier Tubes, PMTs) 檢測特定波長範圍的螢光訊號。每種螢光染料被分配到特定通道,但其發射光譜通常較寬,易與其他染料產生光譜重疊 (spectral overlap),導致訊號溢漏 (spillover)。為校正此問題,傳統方法需進行螢光補償 (compensation) 計算。

SONY 的光譜流式細胞儀,例如 ID7000™ 和 SA3800™,採用截然不同的檢測方式。它們利用光學元件,如稜鏡 (prisms) 或光柵 (diffraction gratings),將螢光分散成連續光譜,再由多通道 PMT 陣列 (multichannel PMT arrays) 記錄完整波長範圍的強度,一共有186個檢測器,每個檢測器負責記錄約3nm的光譜寬度。使得每種染料因此獲得獨特的「光譜指紋」(spectral signature),即使光譜相似的染料也能被分辨。

隨後,SONY 系統使用光譜拆解演算法 (spectral unmixing algorithm) 分離混合訊號。其核心演算法為加權最小二乘法 (Weighted Least Squares Method, WLSM),該方法考量各通道背景水平 (noise level),對殘差 (residuals) 加權處理,相較傳統最小二乘法 (Least Squares Method, LSM) 更能降低背景影響,提供精確的染料強度估計。

Figure 1. 傳統流式細胞儀(A)使用濾光片選擇特定波長,與光譜流式細胞儀(B)分散光線並由多通道檢測器收集。


光譜拆解 vs. 傳統補償:差異與便利性

傳統流式細胞儀透過溢漏矩陣 (spillover matrix) 進行補償,從某通道訊號中減去其他通道的溢漏。然而,當染料光譜高度重疊或自發螢光 (autofluorescence) 干擾時,補償效果就大大受限。此外,補償需手動調整單染樣本數據,耗時且易有人為誤差。

光譜拆解的優勢

SONY 的光譜拆解技術自動處理光譜重疊,無需手動補償,展現以下優勢:

  1. 更高的染料選擇靈活性 (Increased Panel Design Flexibility)
    完整光譜分析讓研究人員可選擇光譜相近的染料,擴展多色實驗組合範圍。
  2. 更精準的訊號分離 (Improved Resolution of Similar Fluorochromes)
    WLSM 演算法能解析光譜相似的螢光訊號,提供可靠數據。
  3. 強大的自發螢光處理能力 (Accurate Autofluorescence Handling)
    自發螢光被視為獨立訊號分離去除,減少對結果的干擾,特別適用於內源螢光強的細胞。
  4. 更高的靈敏度 (Enhanced Sensitivity)
    完整光譜分析與自發螢光去除提升微弱訊號檢測能力。
  5. 簡化的工作流程 (Simplified Workflow)
    內建光譜庫 (Spectral Library) 儲存單染參考光譜,標準化模式 (Standardization mode) 確保儀器一致性,減少重複單染需求。

Figure 2. 傳統螢光補償和光譜拆解分析。(A)理想情況下,每個染料的光應該只被一個通道接收。例如,DYE1 的光應該只出現在 FL1。但實際上,染料的光會「溢出」到其他通道,比如 DYE1 的光也會跑到 FL2 和 FL3 裡。這種「溢出」讓訊號變得混雜,難以準確分辨哪個訊號來自哪個染料。傳統方法會用一個叫做「溢出矩陣」(Spillover Matrix)的表格來修正這個問題。這個表格記錄了每個染料的光在不同通道中的溢出程度。科學家根據這個表格,計算並「扣除」溢出的部分,讓每個通道的訊號變得更乾淨。(B)光譜流式細胞儀裡有很多個通道(1、2、3…),這樣可以更仔細地觀察染料的光,圖中每個柱子代表一個通道接收到的訊號強度。當細胞被多種染料標記時,接收到的訊號是所有染料混在一起的結果。光譜流式細胞術會用「光譜分解」的方法,根據每個染料的參考光譜也像是獨特光譜指紋,把混合的訊號分開,讓每個染料的訊號變得清楚。

Figure 3. Unmixing auto-FL in 9-color bone marrow panel.

技術優勢與多色分析潛力

ONY 的旗艦產品 ID7000 展現了光譜拆解在高參數分析中的潛力。它配備多達 7 支雷射 (320 nm 至 808 nm) 和 186 個檢測器,覆蓋 360 nm 至 920 nm 的光譜範圍。其 InGaAs PMT 專為超過 800 nm 的訊號設計,結合先進信號處理技術降低電子雜訊,提升訊噪比。

目前,ID7000 可同時分析 52 種以上的螢光標記,遠超傳統流式細胞儀的極限。這得益於其光柵式光譜收集系統和高靈敏度檢測器,能捕捉更多光子並均勻分佈訊號,提供卓越解析度。


Flowpoint 技術讓高速分析的SONY 流式細胞儀更穩定

在流式細胞儀的應用中,核心流動的穩定性 (core flow stability) 和精確的追蹤 (precise tracking) 是確保細胞測量可靠性的關鍵因素。

SONY FlowPoint 技術的靈感源自於藍光光碟技術 (optical Blu-ray disk technology) 中廣泛應用的散光法 (astigmatic method) 。以在行駛中的汽車上觀看 Blu-ray 影片為例,即使環境不穩定,光碟也能以極高的密度和速度運行並避免錯誤 。類似地,FlowPoint 技術利用相同的原理,實現對流式細胞儀流動室內粒子的精確追蹤,從而提升測量的可靠性 。

散光法是一種光學技術,其核心概念是透過柱狀透鏡 (cylindrical lens) 來改變焦點的位置,使得在不同焦平面上的影像呈現不同的形狀 。FlowPoint 技術正是利用了這個特性來感知流動中粒子的位置。

SONY 將散光法的原理融入其光譜分析儀中,開發出 FlowPoint 粒子位置測量系統 (particle position measurement system) 。這項技術能夠測量粒子在液流橫截面位置 (cross-sectional position) 。其運作方式大致如下:

  1. 當細胞或微粒通過流式細胞儀的流動室 (flow cell) 並被雷射照射時,產生的散射光或螢光會被收集。
  2. 這些光線在到達偵測器之前,會通過一個柱狀透鏡 (cylindrical lens) 。
  3. 柱狀透鏡會使原本圓形的光點在不同焦平面上呈現橢圓形,且長軸的方向會隨著焦點位置而改變 。
  4. 通過柱狀透鏡的光線最終會投射到一個四象限光電探測器 (4-channel photodetector, 4chPD) 上 。這個探測器由四個獨立的光敏元件組成(通常標示為 A、B、C、D)。
  5. 儀器會即時分析這四個象限接收到的光訊號強度差異。根據這些差異,FlowPoint 技術能夠計算出通過流動室的每個粒子的橫向和縱向位置 。

FlowPoint 技術的導入為 SONY 光譜分析儀帶來了多項提升可靠性的優勢:

  • 直接監控粒子流動狀態 (Direct monitoring of particle flow status):

FlowPoint 技術能夠直接監測流動室內粒子流動的狀態 。傳統的流式細胞儀缺乏這種能力,往往需要有經驗的操作人員才能判斷是否存在流動不穩定的問題,例如流動室的部分阻塞 (partial obstruction of the flow cell) 或滯留的氣泡 (trapped air bubbles)。FlowPoint 技術則可以即時提供關於流動核心形狀和位置的資訊 ,幫助使用者及早發現並解決潛在的問題,避免實驗誤差 (avoid errors in experiments)。

  • 精確的粒子定位 (Precise particle positioning):

FlowPoint 技術能夠提供每個通過流動室的粒子的精確橫截面位置資訊。這些資訊可以被繪製成圖形(如 FlowPoint 密度圖),圖案的變化反映了粒子的大小和紋理差異 。

  • 數據品質的提升 (Improved data quality):

去除不良事件 (Removal of erroneous events):透過分析 FlowPoint 數據,使用者可以設定閘 (gating),排除那些流動軌跡異常的事件,例如由於氣泡或細胞聚集體導致的數據點 。

  • 減少流體動力聚焦效應的影響 (Reducing the impact of hydrodynamic focusing):

流體動力聚焦是流式細胞儀中使粒子單列通過雷射光束的關鍵機制。然而,不同流線位置的粒子在光學檢測上可能存在微小差異。FlowPoint 技術允許使用者選擇僅分析那些通過流動室中心的粒子,從而降低流體動力聚焦效應對數據變異性的影響,獲得更精確的測量結果 。例如,在細胞週期分析中,僅針對 FlowPoint 圖上位於中心的事件進行分析,可以降低 G0/G1 群體的變異係數 (CV)。

  • 儀器穩定性的驗證 (Verification of instrument stability):

FlowPoint 技術提供的粒子位置資訊也可以作為評估儀器流體系統穩定性的指標,幫助使用者確保儀器在長時間運行過程中保持最佳性能 。

Sony ID7000 Spectral Flow Cytometry